pcr结果如何分析(pcr怎么分析)

pcr结果如何分析

PCR的结果是扩增出目的基因,主要可用于下面几个分析:

1.将PCR产物用于测序,测序结果经过比对(NCBI)确定其物种身份。

2.有些引物为特异性引物,对于一些形态上或(和)分子上难以分辨相似物种,使用这种引物PCR的结果可以作为物种鉴定的一种依据,主要依靠该引物针对相似的几个物种的PCR产物大小不同而区分。

3.另外一些实验,例如克隆,利用PCR进行检测是否转入了目的基因。 这是本人所认知的PCR应用。

pcr实验结果分析

传统的PCR完成后,会通过琼脂糖凝胶——最近更常使用的是毛细管电泳系统——来分辨并分析数据。在某些应用中,例如SNP基因分型,将使用用于分析的端点数据来运行qPCR。在每一种情况下,端点数据都将在PCR达到平台期后提供定性分析。在某些情况下,有可能分析端点数据以对PCR产量进行半定量分析,但更多时候则使用qPCR并对定量循环值 (Cq)1进行分析以进行定量测定。

QPCR数据分析

本指南中,重点强调了使用PCR或qPCR测定核酸时,导致变化产生的因素。为了使得到的测定结果最大可能地接近于反应中基因(靶点)的实际数量,应对每一个因子进行优化。 这些优化过程会为每个样品中的每个靶点生成一组Cq值。本章介绍了推导和分析这些Cq值从而得到可以代表生物学情况的可靠数据的过程。

QPCR定量策略

正确的基线和阈值设置对于可靠的定量而言是必需的。设置完成后,可生成一个Cq值并将其作为定量的基础。然后使用标准曲线或相对/比较定量来确定指定样品中的靶点数量。

标准曲线定量

顾名思义,标准曲线定量需要使用标准曲线来确定测试样品中靶点的数量。因此,为样品确定的数量与标准曲线指定的数量相关。这就需要在每组样品反应的同时运行额外的外部标准。为了消除由于样品和标准品的测定效率不同而造成的潜在的定量差异,应慎重选择用于标准曲线的材料。外部标准的引物结合位点必须和靶点的相同,含有和靶点相同的序列,有相似的复杂性,并且处理方式尽可能相似。因此,当测定cDNA中的靶点浓度时,优先选择在对照样品的连续稀释液中测量相同的cDNA。但是,在一些研究中,实际条件无法做到这一点,因此,需要尽可能的再现样品的条件,例如,将来自与测试物种无关的物种的gDNA加入人工寡核苷酸标准或携带标准序列的线性化质粒中。一旦鉴定出合适的构建体或扩增子,就可以生成一条连续稀释的标准曲线。确定每个标准对应的靶点的Cq值,并与对应的浓度或相对浓度/稀释因子的对数作为坐标轴作图。由此得到标准曲线,从而可以通过比较未知样品扩增后的Cq值,得知测试样品的浓度。当使用标准曲线定量时,阈值必须保持恒定以确定同一平板上标准品和样品的Cq值。不同平板间的阈值可能会不同。

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